引言
紫苏（Perilla frutescens）是陆生植物a-亚麻酸最高的物种之一，广泛分布于亚洲地区，以其独特的红色和绿色叶型而闻名。紫苏是我国传统的药食两用植物，不仅在烹饪中被广泛使用，还因其丰富的营养成分和药用价值而受到重视，在药用及功能食品应用有很大前景。花青素类物质是紫苏叶紫色的主要成色物质。然而，影响紫苏花青素合成的遗传机制尚未得到充分理解。
广州中医药大学王宏斌/沈奇团队最近的一项研究，探讨了红紫苏与绿紫苏之间花青素积累的关键基因及其调控机制。该研究以红色紫苏品种PA21和绿色紫苏品种M84为材料，构建了F2分离群体。采用BSA-seq分析（Bulk segregation analysis）和BSR-seq（Bulked Segregant RNA-Seq）技术，对代表性样品进行混合测序。通过对chr8染色体上的6.0 Mb候选区域和差异表达基因的分析，识别出了PfMYB113b、PfC4H1和PfF3H三个关键基因，这些基因在花青素生物合成中发挥着重要作用。该研究的结果将有助于深入理解紫苏叶片颜色的遗传调控机制，为未来紫苏的育种和应用提供科学依据。
文章导读
1.表型特征及遗传分析发现紫色性状在紫苏F2代群体中存在明显分离
为研究紫苏叶片颜色表型的遗传特征，该研究以红色紫苏品种PA21为母本，绿色紫苏品种M84为父本，构建了一个遗传群体。F1代植株表现出浅红色表型，然后将其自交产生F2代。随后通过进一步的表型和遗传分析了发现F2群体的叶片紫色性状具有明显的分离，PA21的总花青素含量显著高于M84，F1杂交系的总花青素含量介于两个亲本之间（图1a）。在F2代中，花青素含量呈偏态分布，表明不同花青素水平的植株之间存在显著差异（图1b）。接着选择花青素含量高和低的F2代植株分别创建混合池进行BSA和BSR分析。
图1.紫色群体的表型与遗传分析
2.紫苏群体的BSA-seq和BSR-Seq分析得到与紫苏叶片颜色变化相关的重要区域与候选基因
经过数据筛选，选择高值亲本PA21作为参考亲本，对两池间的238,808个SNP标记位点进行分析。这些变异不均匀地分布在染色体上，Chr8显示出最多的SNP位点（图2a）。使用Δ（SNP/Indel-index）方法，95%置信区间，确定候选变异区域在Chr8上的范围为1.80 ~ 21.80 Mb（图2b）。为了验证基因表达并确定染色体的候选区域，研究进一步对相同的亲本和混池样品进行了基于转录组测序的BSR-Seq。最后在混合池测序数据中，chr8被确定为与紫苏叶片颜色变化相关的重要区域，具体跨度为11.00 - 17.30 Mb。通过整合BSA-Seq和BSR-Seq数据，发现有19个基因在M84和PA21之间以及G-pool（low-value mixed pool generation)和R-pool(high-value mixed pool generation)之间表现出一致的差异表达（图2c-d）。这其中包括已经确定在类黄酮和花青素的生物积累中起着关键的正调控作用的MYB113转录因子（PfMYB113b），以及参与花青素生物合成的关键催化酶肉桂酸-4-羟化酶（PfC4H1）和类黄酮-3-羟化酶（PfF3H）。qRT-PCR分析证实PfMYB113b、PfC4H1和PfF3H在PA21中的表达水平明显高于M84（图2e）。
图2.紫苏群体的BSA-seq和BSR-Seq分析
3.PfMYB113b可调节PfF3H和PfC4H1基因的表达从而促进花青素积累
通过启动子的顺式作用元件分析，该团队发现PfC4H1和PfF3H基因启动子包含MYB样序列（TAACCA）等结合元件，这提示MYB转录因子对PfC4H1和PfF3H基因具有潜在的调节作用（图3a）。成功克隆PfMYB113b的编码序列并插入猎物重组质粒pGADT7中（图3b）。而包含MYB结合元件的PfC4H1pro片段（-1000 ~ -500 bp）和PfF3Hpro片段（-1700 ~ -1200 bp）被合成并整合到诱饵重组质粒pAbAi中（图3b）。酵母单杂交系统（Y1H）分析验证了PfMYB113b与PfC4H1和PfF3H之间的相互作用（图3c）。利用农杆菌系统对紫苏幼苗子叶进行瞬时转化（图3d），以空载体作为阴性对照，处理7天后发现绿紫苏子叶中积累了花青素，呈现紫红色颜色（图3e）。此外，PfMYB113b的表达水平显著上调（图3f），表明其具有增强紫苏叶片花青素合成的潜力，并且在花青素积累的子叶中，PfC4H1和PfF3H的表达水平也显著升高（图3f），这表明PfMYB113b可能通过调节PfC4H1和PfF3H的转录促进紫苏花青素积累。
图3. PfMYB113b与PfC4H1和PfF3H的互作分析及PfMYB113b的功能分析
4. 红绿紫苏PfMYB113b启动子区域的重复序列差异可能引起其基因表达差异
在团队前期的研究中，Myb113上游的长末端重复序列（LTRs）的插入会影响基因表达和颜色形成。有趣的是，团队在该研究的chr8上发现了PfMYB113b启动子的变异，而在编码区没有发现明显的变异（图4）。具体来说，PfMYB113b基因上游5kb区域的2个碱基插入和（ATA）4/5串联重复的缺失（图4b）。值得注意的是，这个重复序列的缺失位点在红色亲本中是杂合，在绿色亲本中是纯合。统计分析表明，在R-pool中，完整reads与缺失reads的比例约为1:1，在G-pool中为2:1（图4c-d）。这些结果提示，该序列的缺失可能会影响PfMYB113b的表达，进而影响花青素生物合成途径中基因的调控和红叶性状的发育。
图4.PfMYB113b的启动子分析
亮点
1. 研究揭示了影响紫苏叶片红色形成的关键基因。研究通过构建F2分离群体，采用BSA-seq和BSR-seq技术，成功识别出位于8号染色体上的6.0 Mb候选区域，并确定了PfMYB113b、PfC4H1和PfF3H三个关键基因在紫苏花青素生物合成中的重要作用。
2. 研究发现PfMYB113b启动子的重复序列插入导致了基因表达水平的变化，从而影响花青素的合成。通过基因表达验证和转录组分析，进一步阐明了PfMYB113b与PfC4H1和PfF3H之间的调控关系。
3. 研究丰富了对紫苏这一传统药食两用植物的理解，为紫苏的育种和应用提供了理论基础，为其在食品和药品领域的应用提供了新的科学依据，为植物花青素合成的研究提供了新的视角。
该研究以“Molecular mapping of candidate genes in determining red color of perilla leaf”为题发表在Advanced Biotechnology。广州中医药大学中药学院药用植物生理生态研究所的王宏斌教授和沈奇研究员为该项工作的共同通讯作者，博士后谢观雯为本文的第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、中国博士后基金项目资助。
